核桃是蔷薇科桃属植物，主要生长在中国西藏等地区，
       具有耐旱、耐寒、遗传多样性高等优良特点，多酚氧化酶是一类含铜的氧化还原酶，能够催化酚类底物的氧化，
       在植物中广泛分布。
       我们以核桃作为研究材料，利用基因克隆技术获得核桃PmPPO基因，通过生物信息学分析了PmPPO蛋白的理化性质及亚细胞定位;通过对核桃酵母文库的筛选及双荧光素酶互补技术鉴定了PmPPO的互作蛋白:分析了核桃中PmPPO对干旱和外源脱落酸的响应机制:获得PmPPO转基因拟南芥，通过对相关生理指标的测定和基因表达的变化，探究干早胁迫下核桃PmPPO基因的功能。

       PmPPO基因对核桃的影响
       利用在线分析软件GOR4预测目的蛋白的二级结构，PmPPO蛋白二级结构包含22.4%的a-螺旋、16.30%的扩展链和59.42%的无规则卷曲，主要由无规则卷曲组成;利用在线分析网站InterProScan对核桃PmPPO蛋白结构域进行预测，
       在PmPPO氨基酸序列N端含有TyrosinaseCu-bd结构域，
       在℃端具有PPO1DWL结构域和PPOIKFDV功能未知结构域，蛋白质多肽链在二级结构基础上通过盘曲、折叠形成有一定规律的三维空间结构。
       运用Swiss-Model在线分析软件对核桃PmPPO蛋白的三级结构进行预测，预测出的三级结构模型PDB序列号为6els.1.A，其寡聚状态显示为Monomer，与目标序列的一致度为86.48%，说明该模型可用于核桃PmPPO蛋白三级结构的分析模型。


       蛋白质中的跨膜区通常与细胞功能解密相关，利用TMHMM2.0网站预测PmPPO蛋白的跨膜结构域，结果如图3-2D所示，PmPPO蛋白不具备跨膜结构域，1-589位氨基酸位于细胞膜表面。利用SignalP-4.1在线网站对核桃PmPPO蛋白的信号肽进行预测，结果如图3-2E所示，原始剪切位点C-score分析PmPPO蛋白在16号位置处得分最高为0.125、综合剪切位点Yscore分析在16位置处得分最高为0.121、信号肽S-score分析在1号位置处得分最高为0.121:信号肽得分的均值S和最大综合剪切位点加权均值D分别是0.120和0.137，该蛋白S和D的值分别为0.108和0.114，均小于标准参数0.450，结果表明核桃PmPPO蛋白无信号肽，推测其属于胞内蛋白。


       利用DNAMAN8.0对核桃PmPPO及其他植物的PPO氨基酸序列进行比对分析，
       结果如图3-3所示，PmPPO的TyrosinaseCu-bd结构域(第162-371位氨基酸)
       、PPO1DWL结构域(第377-428位氨基酸)及PPO1KFDV(第461-587位氨基酸)作为蛋白的功能结构域，在多物种之间表现出高度的一致性，进化过程中保持高度的保守性。
       运用MEGA5.0软件构建PmPPO氨基酸序列的系统发育进化树，结果如图3-4所示:选取12个与核桃PmPPO氨基酸序列同源性较高的物种，构建系统发育进化树，其中核桃PmPPO与碧桃PpPPO亲缘性最近，与扁桃PdPPO、杏PaPPO、东京樱花PyvPPO、柰李PsPPO次之。


       为了探究PmPPO蛋白的亚细胞定位情况，利用Wolfpsont网站预测该蛋白主要位于叶绿体和线粒体中，Psort网站预测该蛋白可能位于线粒体、
       细胞核、过氧化酶体及细胞质。构建重组质粒pBI121-PmPPO，利用特异性引物pBI121-PmPPO-F/R对pMD18-T-PmPPO质粒进行扩增，
       将PCR扩增产物与双酶切的pBI121载体质粒进行胶回收，利用同源重组技术挣钱软件平台构建表达载体，再转化大肠杆菌中，挑取阳性单克隆菌落进行PCR验证。
       在荧光显微镜下观察，以GFP空载体(pBI121)为对照，pBI121-PmPPO在烟草表皮细胞的细胞核和叶绿体中均出现绿色荧光(图3-6A);在洋葱表皮细胞的细胞膜和细胞核出现荧光反应，结果表明:PmPPO蛋白定位于细胞核、叶绿体及细胞膜。


       PmPPO基因在核桃的表达分析
       分别提取核桃幼嫩植物叶片及根、木质部、韧皮部和两年龄叶片及根的RNA，并将其反转录为cDNA，qRT-PCR检测核桃中PmPPO基因的表达量，以18s作为内参，结果如图3-16所示:PmPPO基因在核桃植株中均有表达，以在木质部的基因表达量作为对照，该基因在核桃的根部的表达量最高，尤其是在幼根中的表达量最为突出;其次在核桃幼嫩叶片中表达量较高。由此可见，PmPPO基因主要在核桃的根部表达、叶片次之，PmPPO基因主要在植物生长前期发挥作用。


       取100μMABA处理0、1、2、4、8、12和24h后的叶片，qRT-PCR技术检测核桃叶片中PmPPO基因的表达量，以18s作为内参引物，结果如图3-17A所示:以0h时PmPPO基因表达量作为对照，在0-4h基因表达量差异不显著，在8h基因表达量最高，在12h后基因表达量下降，ABA处理后该基因表达量呈先上升后下降的趋势。
       使用10%PEG6000处理一年龄核桃植株，分别在0、1、2、4、8、12和24h测定核桃PmPPO基因表达量，
       在1h目的基因表达量短暂上升，随后目的基因表达量降低，在12h基因表达量显著上调，24h目的基因表达量持续增长。
       干旱胁迫处理核桃后，分别在0、8、12、16和20d检测核桃叶片及根中PmPPO基因表达量，结果如图3-17℃和D所示:干旱胁迫后，在0-16d核桃叶片中PmPPO基因表达量呈上升趋势，16d表达量最高，在20d基因表达量下降，
       但是高于0d，在核桃叶片中PmPPO基因表达量呈先上升后下降趋势，主要在中后期响应干旱胁迫:干旱胁迫后，0-8dPmPPO基因在核桃根部的相对表达量无差异显著性，
       12d后PmPPO基因的表达量升高，干旱处理20d时达到峰值，核桃根部的目的基因在干旱胁迫后期响应。以上结果表明:核桃的P挣钱软件平台mPPO基因被干早和PEG6000诱导表达，并响应ABA处理。


       将WT和PmPPO转基因拟南芥置于含有不同浓度的甘露醇或ABA的MS培养基上培养，根据图3-19可知:在MS培养基中，
       OE1和OE3转基因株系的主根长度略高于WT，经过不同浓度的甘露醇处理后，
       WT和转基因株系根部的生长均受到不同程度的抑制，转基因株系主根长度显著高于WT，受到抑制程度较小。
       使用不同浓度的ABA处理后，WT和转基因株系的主根长度显著下降，且转基因株系主根长度相较于WT受到抑制程度更为明显，这种现象在25μMABA处理条件下尤为显著(图3-19C和D)。由此可以得出:PmPPO转基因拟南芥与WT相比，在甘露醇胁迫下，增强了拟南芥的抗渗透胁迫能力，且对外源ABA敏感。


       为了进一步验证核桃PmPPO基因在干旱胁迫下的功能，本试验选取在营养土中生长两周左右的WT和转基因拟南芥进行干旱处理，分别在干旱0、4、10d及复水2d(12d)后进行观察，并测定不同时期的生理指标。
       拟南芥受到干旱胁迫后，细胞膜遭到破坏，通过相对电导率变化可以反映这一现象，由图3-20B可知:在正常条件下WT和转基因拟南芥株系之间无差异显著性
       ，干早处理10d后，拟南芥叶片相对电导率增长，细胞膜通透性增大
       ，转基因拟南芥的相对电导率低于WT。
       干旱影响拟南芥的生长，使叶片中叶绿素的含量降低，测量0d和干旱处理10d后的拟南芥叶片中相对叶绿素含量，结果如图3-20D所示:在0d时所有拟南芥叶片中的相对叶绿素含量无显著差异，干早处理10d后，所有拟南芥相对叶绿素含量有显著下降趋势，但WT的叶片的相对叶绿素含量显著低于转基因拟南芥。因此，在干旱胁迫下，PmPPO基因在拟南芥中过量表达能够促进叶绿素的积累、调节PPO活性及减轻细胞膜损伤，从而增强了植物的抗旱性。


       结语
       为深入研究PmPPO蛋白的特性和功能，体外诱导表达是关键环节之一。本研究探索并优化了PmPPO蛋白体外表达的条件，
       利用镍柱亲和层析法纯化带有His标签的重组PmPPO蛋白。本试验结果显示:PmPPO蛋白主要以不可溶蛋白的形式存在，沉淀中蛋白表达量较高。
       生物信息学预测蛋白的相对分子质量为65.45kDa，而在SDS-PAGE检测的蛋白胶图中蛋白的分子量相比预测值偏大，这可能是由于His标签中含有6个His带有较强的正电荷，降低了PmPPO蛋白的泳动速率。
       有关研究表明通过对茶树CSPPO蛋白的外源表达发现，在pMAL-c5X载体表达可获得可溶性蛋白，而在pET-32a载体中则不能过得可溶性蛋白，利用不同pH值及不同底物处理目的蛋白，PPO的比活力存在差异!721。构建芝麻pMAL-c5X-BSPPO重组表达载体，利用不同的金属离子、pH值以及底物处理纯化后的目的蛋白，探究芝麻BSPPO的酶学特性。
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